Uloshengitysilman typpioksidimääritys - hengitystietulehduksen uusi osoitin

Typpioksidin (NO) keskeinen osuus elintoiminnoissa on selvinnyt vasta muutamia vuosia sitten (1). Typpioksidi säätelee verisuonten jänteyttä sekä toimii hermoston ja tulehdusreaktioiden välittäjäaineena (2). Typpioksidimuodostuksen muutoksia on havaittu sydän- ja verisuonitaudeissa, keuhkosairauksissa sekä käyttäytymisen ja seksuaalitoimintojen häiriöissä (3,4).

TYPPIOKSIDIN MUODOSTUMINEN HENGITYSTEISSÄ

Hengitysteissä typpioksidi laajentaa keuhkoverisuonia ja keuhkoputkia sekä toimii nonadrenergisen ja nonkolinergisen hermotuksen ja tulehdusreaktioiden välittäjäaineena (5).

Kuviossa 1 on esitetty kaavamaisesti typpioksidisynteesin tärkeimmät vaiheet hengitysteissä. Typpioksidisyntaasia (NOS) esiintyy hengitysteissä ainakin kolmea tyyppiä (6). Synteesin lähtöaine on L-arginiini, jonka saatavuus vaikuttaa tuotetun typpioksidin määrään. Konstitutiivisesta typpioksidisyntaasista (cNOS) on kaksi isoformista muotoa, jotka syntetisoivat typpioksidia endoteelisoluissa (ecNOS) ja hermosoluissa (nNOS). Reaktiot edellyttävät kalsiumioneja ja synteesin muutokset tapahtuvat sekunneissa. Hengitysteiden endoteeli-, epiteeli- ja tulehdussoluissa toimii entsyymin kolmas muoto, indusoituva typpioksidisyntaasi (iNOS). Ainakin sytokiinit, endotoksiinit ja lipopolysakkaridit aktivoivat sitä. Koska aktivaatio tapahtuu geenitranskription kautta, sen vaikutukset ilmenevät hitaammin kuin konstitutiivisen muodon aikaansaamat. Tapahtuma ei ole riippuvainen kalsium- ioneista. Syntynyt typpioksidi relaksoi sileää lihasta syklisen guanosiini-3'5'-monofosfaatin (cGMP) välityksellä (7).

TYPPIOKSIDIN MÄÄRITTÄMINEN ULOSHENGITYSILMASTA

Indusoituvan entsyymin käynnistämä synteesi tuottaa suurempia määriä typpioksidia kuin konstitutiivisesti tapahtuva synteesi. Koska tuotanto tapahtuu pääosin hengitysteiden pintasolukossa, erittyy NO-kaasua helposti hengitysilmaan. Kaasufaasissa typpioksidi on stabiilimpi kuin kudoksessa ja sen pitoisuudet hengitysilmassa ovat riittäviä uusien tekniikoiden avulla analysoitaviksi (8).

Kemiluminesenssimenetelmässä hapesta tuotetaan otsonia, joka reagoi mittauskammiossa uloshengitysilman sisältämän typpioksidin kanssa seuraavan yhtälön mukaan:

NO + O3 Æ NO2* + O2 Æ NO2 + fotoneita

Mitä enemmän näyte sisältää typpioksidia, sitä voimakkaampaa on reaktiossa syntyvä, mitattava valosäteily, joka muutetaan sähkösignaaliksi. Parhailla laitteilla saavutettava mittaustarkkuus on tällä hetkellä noin 1-2 ppb (parts per billion). Esimerkiksi pulmonaalihypertension typpioksidihoidoissa käytetään siihen verrattuna yli 1 000-kertaisia pitoisuuksia.

Hengitysilmanäyte typpioksidimääritystä varten voidaan ottaa usealla tavalla. Ilmaa voidaan kerätä pussiin, josta näyte otetaan. Kaasua voidaan myös imeä suoraan uloshengitysilmasta mittauskammioon, jolloin saadaan jatkuva typpioksidipitoisuuskäyrä hengitys hengitykseltä. Mittauksessa pyritään mahdollisimman tasaiseen ja rauhalliseen uloshengitysvirtaukseen. Joissakin tutkimuskeskuksissa, kuten Meilahden sairaalan kliinisen fysiologian laboratoriossa, on käytetty mittauksen herkistämiseksi kymmenen sekunnin pidätysvaihetta ennen uloshengitystä, jolloin typpioksidia ehtii kumuloitua enemmän uloshengitysilmaan. Tuloksena ilmoitetaan uloshengitysilman typpioksidin huippupitoisuus (ppb), joka ajoittuu yleensä puhalluksen alkuvaiheisiin (anatominen kuollut tila). Huippupitoisuuden korrelaatio koko puhalluksen ajalta mitattuun typpioksidimäärään on erittäin hyvä (9).

Tärkeä virhelähde on ympäröivästä ilmasta keuhkoihin joutunut typpioksidi. Pakokaasupäästöt sisältävät monia typen oksideja. Niitä voi etenkin epäedullisissa sääoloissa, kuten tuulettomalla pakkasilmalla, olla niin paljon, että ne rajoittavat tavanomaisen huoneilman käyttöä sisäänhengityskaasuna. Saastevaikutusta voidaan vähentää käyttämällä kemiallisesti puhdistettua sisäänhengitysilmaa tai puhdasta happea (10). On myös huomattava nenän limakalvon ja sivuonteloiden merkittävä osuus typpioksidituotannossa (11,12) varsinkin tulehdustiloissa.

ULOSHENGITYSILMAN TYPPIOKSIDIMÄÄRITYS HENGITYSTIESAIRAUKSISSA

Hengitysteiden limakalvon tulehdus aktivoi indusoituvan entsyymin, jolloin typpioksidituotanto alkaa voimistua. On mahdollista, että inflammaation alkuvaiheessa typpioksidin keuhkoputkia laajentava vaikutus vähentää jossain määrin bronkokonstriktiivisten välittäjäaineiden haittoja (13). Tulehduksen vaikeutuessa typpioksidin kasvanut tuotto alkaa muuttua haitalliseksi. Verisuonien laajentuminen lisää kudosturvotusta ja hengitysteiden limaisuus voimistuu. Typen oksidien ja happiradikaalien reaktiot voivat aiheuttaa solutason häiriöitä.

Lisääntynyt indusoituvan entsyymin ylläpitämä typpioksidituotanto "kuluttaa" substraattia ja konstitutiivisen perustuotannon määrä voi pienentyä. Epiteelin vaurioituminen voi muuttaa typpioksidituotannon tasapainoa. Kortikosteroidit vähentävät sekä indusoitunutta typpioksidituotantoa että tulehduksen muita osatekijöitä (14,15). Astman synnyssä keuhkoputkien limakalvotulehduksella on keskeinen osuus (16). Useissa tutkimuksissa on osoitettu uloshengitysilman typpioksidipitoisuuden olevan lisääntynyt hoitamattomilla astmaatikoilla (8,14). Suurentuneita pitoisuuksia on mitattu eräissä muissakin tulehdussairauksissa kuten bronkiektasiataudissa (17). Eläinkokeissa on havaittu, että pneumonia, johon liittyy sepsis, lisää hengitysilman typpioksidipitoisuutta (18). Runsasoireista allergista nuhaa sairastavilla on todettu alempienkin hengitysteiden typpioksidituotannon kasvua ilman astman kliinisiä löydöksiä (19).

Fyysinen rasitus ja kestävyysharjoittelu voivat lisätä typpioksidituotantoa (20,21). Lisääntyminen näyttää olevan enemmän riippuvainen verenkierron kuin keuhkotuuletuksen muutoksista. Kuitenkin myös hyperventilointi ilman fyysistä rasitusta saattaa suurentaa uloshengitysilman NO-pitoisuutta (14). Eräissä keuhkoverenkiertoa primaaristi tai sekundaarisesti heikentävissä sairauksissa NO-tuotannon lisäys jää rasituksessa poikkeavan vähäiseksi (22). Pieniä uloshengitysilman typpioksidipitoisuuksia on todettu potilailla, joilla on heikentynyt hengitysteiden värekarvatoiminta (23) tai verenpainetauti (11).

Tupakointi vähentää NO-pitoisuutta (8). Tupakansavun komponentit inhiboivat indusoituvaa NO-syntaasia. Täydellinen palautuminen kestää jopa puoli vuotta tupakoinnin lopettamisen jälkeen. On esitetty, että tupakoijilla ohitusleikkauskirurgian jälkeisten keuhkokomplikaatioiden vaara lisääntyy tupakan typpioksidituotantoa lamaavan vaikutuksen vuoksi (24).

Äskettäin on todettu, että kuukautiskierto modifioi syklisesti typpioksidituotantoa (9). Uloshengitysilman NO-pitoisuudet ovat kaksinkertaiset perustasoon nähden keskisyklissä ja pienimmillään menstruaation aikaan. Tällä on arveltu jopa olevan osuutta premenopaussi-ikäisten naisten suhteelliseen vähäiseen verisuonitautien vaaraan.

OMAT KOKEMUKSET

HYKS:n Meilahden sairaalan kliinisen fysiologian laboratoriossa on kesästä 1995 lähtien ollut käytössä ensimmäisenä Suomessa kemiluminesenssiperiaatteella toimiva typpioksidianalysaattori (Sievers 270 B NOA, Sievers Instruments Inc., Boulder, Colorado, USA). NO-pitoisuutta seurataan lepohengityksen ja 10 sekunnin mittaista hengityksenpidätystä seuraavan hitaan uloshengityksen aikana. Tutkimus toistetaan kahden minuutin välein. Uloshengitysilman suurin NO-pitoisuus (NO-huippupitoisuus, ppb) hengityksen pidättämisen jälkeen on osoittautunut herkäksi muuttujaksi testissä. Tuloksena ilmoitetaan kahden mittauksen keskiarvo. Mittauksen ajan tutkittava hengittää 100-prosenttista happea kaksiventtiilisen suukappaleen kautta (kuva 2) huoneilmasta eristetyssä järjestelmässä. Kalibraatio tehdään päivittäin 100-prosenttisella hapella (NO-pitoisuus 0 ppb) ja 200 ppb typpioksidia sisältävällä testikaasulla (Oy AGA Ab). Hengityksen monitoroimiseksi mittauksen aikana on järjestelmään liitetty virtausanturi.

Järjestelmän PC-pohjainen analyysi- ja ohjausjärjestelmä on testausvaiheessa. Tutkimus on potilaalle varsin vaivaton ja kokeen edellyttämä hengitystekniikka on helppo oppia. Tutkimus kestää potilasohjauksineen noin 20 minuuttia.

Julkaistuja uloshengitysilman typpioksidipitoisuuden viitearvoja ei ole vielä saatavilla. Terveille henkilöille suorittamiemme mittausten mukaan normaali NO-huippupitoisuuden yläraja hengityksen pidätyksen (10 s) jälkeen on noin 50 ppb. Kuviossa 3 nähdään tyypillinen mittauskäyrä. HYKS:ssa on tähän mennessä tehty standardoitu mittaus noin 300 tutkittavalle.

Kuviossa 4 on esitetty 41:n HYKS:n keuhkosairauksien poliklinikkaan astmaepäilyn vuoksi lähetetyn tupakoimattoman alle 60-vuotiaan potilaan ja 27 vastaavanikäisen terveen tupakoimattoman henkilön uloshengitysilman NO-huippupitoisuudet. Potilaat on jaettu kahteen ryhmään. Toisessa ryhmässä ("astma") astmadiagnoosi voitiin varmistaa objektiivisin löydöksin. Toisessa ryhmässä ("ei-astma") astman diagnostiset kriteerit täyttäviä löydöksiä ei todettu, vaikka potilailla oli lieviä astman kaltaisia oireita. Astman kriteereinä olivat kliinisten astmatyyppisten oireiden lisäksi: 1) uloshengityksen huippuvirtauksen vuorokausivaihtelu vähintään 20 % ainakin kolmen vuorokauden aikana viikon seurantajaksona tai 2) vähintään 15 %:n bronkodilataatiovaste uloshengityksen huippuvirtauksen kotiseurannassa ainakin kolme kertaa viikon aikana tai 3) uloshengityksen sekuntikapasiteettiarvon paraneminen vähintään 15 % ja 200 ml dynaamisen spirometrian yhteydessä.

Selvästi suurentuneita pitoisuuksia esiintyi vain astmaryhmässä. Siinä keskimääräinen NO-pitoisuus oli merkitsevästi suurempi (p < 0,05, Wilcoxonin testi) kuin ei-astmaryhmässä tai terveillä verrokeilla. Ei-astmaatikkojen ja terveiden verrokkien välillä merkitsevää eroa ei havaittu. Ainoastaan kahdella potilaalla ei-astmaryhmässä pitoisuus ylitti 50 ppb. Terveistä verrokeista ei yhdelläkään todettu yli 50 ppb:n pitoisuuksia.

Kuviossa 5 on esitetty yhdeksän kliinisesti oireilevan astmapotilaan uloshengitysilman NO-huippupitoisuudet ennen anti-inflammatorista lääkehoitoa ja hoidon jälkeen. Hoito (inhaloitava kortikosteroidi vähintään kaksi kuukautta) annoksena 400-800 myyg/vrk budesonidia tai 250-500 myyg/vrk flutikasonia vähensi merkitsevästi (p < 0,001) NO-huippupitoisuutta niillä potilailla (n = 5), joilla NO-huippupitoisuus oli tavanomaista suurempi (> 50 ppb) lähtötilanteessa. Kaksi potilasta, joilla todettiin selvästi muita pienemmät lähtöarvot eikä muutosta hoidon myötä, olivat potilasryhmän selvästi iäkkäimmät henkilöt.

TUTKIMUKSEN KÄYTTÖALUEET

Tärkein uloshengitysilman typpioksidimäärityksen käyttöalue on tulehduksellisen osatekijän selvittely keuhkosairauksissa. Suurentunut pitoisuus viittaa tulehdukseen. Menetelmä on noninvasiivinen ja analyysitulos saadaan heti. Tutkimus on potilaalle helppo ja tulokset toistettavia. Erittäin hyvin tutkimus soveltuu seurantaan esimerkiksi arvioitaessa anti-inflammatorisen lääkityksen tehoa astmapotilaille. Omat tuloksemme tukevat käsitystä uloshengitysilman NO-huippupitoisuuden määrityksen käyttökelpoisuudesta uutena, erityisesti astmapotilaiden tutkimusmenetelmänä (25). Lasten astmadiagnostiikassa on saatu lupaavia tuloksia nenähengitysilman NO-analyysista (19).

Menetelmän spesifisyys ja sensitiivisyys astman diagnostiikassa on vielä epäselvä, samoin iän vaikutus typpioksidituotantoon. Koska hengitystieinfektio saattaa lisätä NO-synteesiä hengitysteissä, tulee inflammaation ja astman diagnostiikassa väliajan infektion kliinisestä paranemisesta olla riittävän pitkä aika, mahdollisesti 4-6 viikkoa. Asiasta ei kuitenkaan ole riittävästi tutkimustuloksia.

Virhelähteiden eliminointi asettaa tutkimuksen tulkinnalle ja tutkimusympäristölle erityisvaatimuksia. Laaduntarkkailuun liittyvien tarpeiden ja laitteiston kalleuden vuoksi ainakin lähitulevaisuudessa tutkimus tulee kuulumaan lähinnä keuhkofunktiotutkimuksiin perehtyneisiin laboratorioihin. Metodiikan kehittämisessä pyritään kansainväliseen standardointiin mm. eurooppalaisena yhteistyönä (Euroopan keuhkolääkäriyhdistyksen työryhmä).

KIRJALLISUUTTA